Testanforderungen für ELISA-Kits

Achten Sie beim formalen Test auf einen guten Kontrast, die Testbedingungen der Positiv- und Negativkontrolle sollten eingehalten werden und die zu testenden Proben sollten in zwei Kopien angefertigt werden, um die Genauigkeit der Testergebnisse sicherzustellen.

Manchmal ist der Hintergrund höher, was auf eine unspezifische Reaktion hinweist, die durch Schafserum, Kaninchenserum oder BSA geschlossen werden kann.

Auswahl der Versuchsbedingungen

Beim ELISA ist es wichtig, verschiedene Versuchsbedingungen auszuwählen, darunter: (1) Wahl der Festphasenträger: Viele Substanzen können als Festphasenträger verwendet werden, wie z. B. PVC, Polystyrol, Polyacrylamid und Cellulose. Es kann die Form einer konkaven Platte, eines Reagenzglases, einer Perle usw. annehmen. Derzeit werden üblicherweise konkave Platten aus Polystyrol mit 40 Vertiefungen verwendet.

Unabhängig von der Art des Trägers kann vor der Verwendung ein Screening durchgeführt werden: Mit der gleichen Menge an Antigenpaket soll unter den gleichen Versuchsbedingungen reagiert werden, um zu beobachten, ob seine Farbwiedergabereaktion homogen ist, was zu einer guten Adsorptionsleistung führt. (2) Paket durch Antikörper- (oder Antigen-) Auswahl: Antikörper (oder Antigen) adsorbiert auf der Oberfläche des Festphasenträgers, die Anforderungen sind besser, die Adsorption erfordert im Allgemeinen einen pH-Wert zwischen 9,0 und 9,6. Auch Adsorptionstemperatur, -zeit und Proteinmenge haben einen gewissen Einfluss, im Allgemeinen mehr als 4 Grad C 18 bis 24 Stunden. Die optimale Konzentration von Proteinpackungen muss titriert werden: Nach der Verpackung mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen (0,1, 1,0 und 10 µg/ml usw.) werden die OD-Werte der positiven Proben beobachtet, wenn andere Testbedingungen gleich sind. Wählen Sie die Konzentration mit dem größten OD-Wert und der niedrigsten Proteinmenge.

Bei den meisten Proteinen liegt sie üblicherweise bei 1 bis 10 µg/ml. (3) Auswahl der Arbeitskonzentration des enzymmarkierten Antikörpers: Erstens der anfängliche Effekt der Titration mit der direkten ELISA-Methode (siehe Teil des enzymmarkierten Antikörpers).

Legen Sie dann andere Bedingungen fest oder verwenden Sie die „Quadrat-Array-Methode“ (Packung kantig, Referenz für die zu untersuchende Probe und enzymmarkierte Antikörper sind unterschiedliche Verdünnungen) im formalen experimentellen System, um die Arbeitskonzentration genau zu titrieren. (4) Die Wahl der Base des Enzyms und des Wasserstoffdonors: Die Wahl des Wasserstoffdonors ist kostengünstig, sicher, weist eine klare Farbgebungsreaktion auf und ist selbst farblos. Einige Wasserstoffspender (z. B. OPD usw.) haben potenziell krebserregende Wirkungen, daher sollte auf Schutz geachtet werden. Bedingte Menschen sollten nicht-krebserregende, hochempfindliche Wasserstoffspender wie TMB und ABTS verwenden, die derzeit zufriedenstellendere Wasserstoffspender sind. Nach einer Einwirkzeit sollten starke Säuren oder Laugen zugesetzt werden, um die Reaktion zu stoppen. Normalerweise ist eine Einwirkzeit des Substrats von 10–30 Minuten angemessen. Die Substratverwendungsflüssigkeit muss frisch zubereitet werden, insbesondere wenn vor der Verwendung H2O2 hinzugefügt wird.